PM2.5 標(biāo)準(zhǔn)品 SRM1649b相關(guān)實(shí)驗(yàn)分析方法:

1.多環(huán)芳烴化合物對表皮真皮細(xì)胞毒性效應(yīng)分析:永生化的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞 HaCaT 細(xì)胞和皮膚成纖維細(xì)胞,NHDF 細(xì)胞為研究對象，以國際準(zhǔn)品空氣顆粒性污染物多環(huán)芳烴化合物 SRM1649b 潯出液為刺激物。研究不同時(shí)間條件下(0 小時(shí)、6小 時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)，36 小時(shí)，小時(shí))不同濃度 SRM1649b 對 HacaT 細(xì)胞和 NHDF 細(xì)胞增殖活性的影響。傳代 HacaT 細(xì)胞和 NHDF 細(xì)胞，顯微鏡下觀察有 70-80%的紐融合時(shí)用于實(shí)驗(yàn)，吸去原培養(yǎng)液，加入專用培養(yǎng)基，稀釋 SRM1649b，使其終濃度為(0、50、100、200、400ug/mL)，在不同濃度，不同時(shí)條件下避光孵育，用 CCK8 法檢測不同時(shí)間點(diǎn)和濃度孵育 SRM1649b 對 HaCaT 細(xì)胞和 NHDF 細(xì)胞增殖活性的影響; 從而探索出不同濃度不同時(shí)間點(diǎn) SRM1649b 浸出液對 HaCaT 及 NHDF 細(xì)胞生存率 的影響并選擇適宜的實(shí)驗(yàn)濃度。

2.采用流式細(xì)胞術(shù)檢測PM2.5 標(biāo)準(zhǔn)品 SRM1649b 對 HaCaT 和 NHDF 的細(xì)胞周期，及凋亡的影響。 采用細(xì)胞免疫熒光法觀塞 空氣顆粒性污染物多環(huán)芳烴合物 SRM1649b 浸出液刺激前后 HaCaT 和 NHDF 細(xì)胞內(nèi)芳香族化 合物受體 AhR 的分布變化;

3.用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 方法檢測各濃度實(shí)驗(yàn)組 HacaT 和 NHDF 細(xì)胞中基質(zhì)金屬 蛋白酶 MMP1，MMP3，MMP9 的 mRNA 表達(dá)情況。用Western-blot 方法檢測各濃度實(shí)驗(yàn) 組 HaCaT 和 NHDF 細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶 MMP1 蛋白表達(dá)情況。用 ELISA 法檢測基質(zhì) 金屬蛋白酶

MMP1 蛋自的細(xì)胞外分泌情況:

4.實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 和 Western-blot 方法檢測 PAHS(SRM1649b 浸出液)與受 體(AhR)結(jié)合后引起的胞漿及核內(nèi)下游靶基因的變化括 ERK1/2, c-Jun 等調(diào)控 分子的磷酸化水平，以及 CYP1A1 等下游靶基因的 mRNA 表達(dá)水平:5.空氣顆粒性污染物多環(huán)芳烴化合物 SRM1649b分析加入 AhR 受體拮抗劑后對 HaCaT 和 NHDF中 MMP1，CYP1A1 等表 達(dá)的影響。

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